国产超碰在线观看|91婷婷一二三区|免费中文视频在线|欧美一级日韩精品|影音AV二色在线|精品久久国产激情|美女网站黄色极品|青青草院视频在线|美女搞黄色无遮挡|青久在线手机视频

血糖變異性(GV)對糖尿病神經(jīng)病變，包括糖尿病中樞神經(jīng)病變和糖尿病周圍神經(jīng)病變(DPN)的影響及其機制尚不完全清楚。本研究采用葡萄糖和胰島素交替腹腔注射的方法，建立了波動型高血糖大鼠模型。為評估糖尿病中樞神經(jīng)病變，采用降壓型被動回避試驗，測定海馬組織中p-Tau、T-Tau、p-GSK3b、GSK3b、 p-Akt、Akt的表達水平。通過測量運動神經(jīng)傳導速度(MNCV)和觀察坐骨神經(jīng)的微觀結(jié)構(gòu)來評估DPN。同時檢測坐骨神經(jīng)氧化應激和炎癥指標的表達水平。我們觀察到GV破壞了學習和記憶能力。GV在海馬中促進Tau磷酸化，抑制Akt/GSK3b通路。此外，GV削弱了坐骨神經(jīng)的MNCV，坐骨神經(jīng)髓鞘和軸突的結(jié)構(gòu)都被破壞。GV還顯著降低了超氧化物歧化酶(SOD)的表達，提高了丙二醛(MDA)、促炎細胞因子(TNF-a和IL-6)和NF-kB的表達水平。綜上所述，本研究強調(diào) GV可能通過抑制Akt/GSK3b通路導致海馬區(qū)Tau過度磷酸化誘導糖尿病中樞神經(jīng)病變，并可能通過激活 NF-kB通路引起氧化應激和炎癥反應導致DPN。

1.介紹

慢性高血糖是糖尿病(DM)并發(fā)癥發(fā)生的主要危險因素;然而，血糖變異性(GV)可能獨立促成糖尿病相關(guān)并發(fā)癥[1,2]。糖尿病神經(jīng)病變包括中樞和周圍神經(jīng)系統(tǒng)，是糖尿病的常見并發(fā)癥。糖尿病中樞神經(jīng)病變以進行性認知障礙為特征，最終可能導致癡呆[3]。近年來，多項研究發(fā)現(xiàn)GV是認知障礙和癡呆的危險因素[4e6]。Tau蛋白異常過磷酸化已被提出在神經(jīng)破壞和認知障礙中發(fā)揮作用[7,8]，但GV是否通過Tau過磷酸化誘導糖尿病中樞神經(jīng)病變尚需進一步研究。先前的研究表明，Akt細胞信號傳導和糖原合成酶激酶3b(GSK3b)參與了Tau過度磷酸化的過程[9,10]。GV可通過抑制Akt/GSK3b引起腎損害[11]，GV是否通過同一途徑影響腦內(nèi)Tau過磷酸化還有待進一步研究。除糖尿病中樞神經(jīng)病變外，GV對糖尿病周圍神經(jīng)病變(DPN)也有影響[12,13]。gv誘導的雪旺細胞凋亡和氧化應激可能參與了這一過程[14]。一項研究發(fā)現(xiàn)，GV可誘導氧化應激和慢性炎癥，進而介導組織和細胞損傷[15]。GV是否通過氧化應激和炎癥誘導DPN，尚需進一步研究。在本研究中，我們檢測了GV對大鼠海馬認知功能和Tau蛋白表達的影響。然后，我們研究了Akt/GSK3b信號通路是否參與了這一過程。其次，我們觀察了GV對坐骨神經(jīng)微觀結(jié)構(gòu)和傳導速度的影響，并測量了氧化應激指標和炎癥因子，探討其可能的機制。

2.材料和方法

2.1.動物

雄性SD大鼠(8周齡，體重200±20g)購自河南省實驗動物中心(中國鄭州)。這些老鼠被喂食正常的食物，并可以自由飲水。室溫保持在25±2℃。

2.2.實驗設(shè)計

將SD大鼠隨機分為3組:正常對照組(NC組)、糖尿病持續(xù)性高血糖組(DS組)和糖尿病波動性高血糖組(DF組)。用鏈脲佐菌素(60mg/kg)誘導糖尿病。3d后取尾靜脈血樣，用血糖儀(Contour TS,Bayer)檢測空腹血糖(FBG)水平，FBG水平為11。1 mmol/L為糖尿病。通過腹腔注射葡萄糖(3g/kg, 9:00)建立振蕩型高血糖動物模型。15:00。和21:00。)常規(guī)胰島素(20 U/ kg,6:00)。12點。and18:00)。每天[16]。NC組和DS組注射等量生理鹽水。每周6點30分、9點30分、12點30分、15點30分、18點30分、21點30分檢測血糖水平，并于第8周和第12周測定平均血糖(MBG)、血糖標準差(SDBG)和最大血糖漂移幅度(LAGE)。

2.3.降壓型被動回避試驗

在第8周的第一天，按照之前的方法進行降壓型被動回避測試[17]。

2.4.免疫組織化學

各組大鼠右腦按前文[2]解剖、固定、孵育、封堵。在每個切片中檢查海馬區(qū)域的三個可見視界。每只大鼠取5個切片進行分析。使用Image Pro-plus 6對圖像進行分析。0軟件。使用抗大鼠p-Tau(pSer202/Thr205,AT-8)和T-Tau (Tau5)的一抗。

2.5.免疫印跡分析

按照前面的方法提取、分離、轉(zhuǎn)移和孵育總蛋白[18]。最后，根據(jù)制造商的說明，用增強化學發(fā)光試劑(Millpore)顯示條帶。本研究使用抗大鼠

p-GSK3b、GSK3b、p-Akt和Akt的一抗(Cell Signaling Technology, MA, USA)。

2.6.坐骨神經(jīng)運動神經(jīng)傳導速度的檢測

第12周，大鼠腹腔注射10%水合氯醛(3ml/kg)麻醉。然后在大腿背處切開，分離肌肉，顯露坐骨神經(jīng)。針刺針與電極相連，針刺針插入脛骨和腓骨肌肉。刺激針電極放置在坐骨神經(jīng)的遠端和近端位置。采用肌電誘發(fā)電位儀(NTS-2000)測量坐骨神經(jīng)的mcv。每只大鼠測量3次，計算平均值。

2.7.坐骨神經(jīng)微結(jié)構(gòu)的電鏡觀察

在MNCV測試后，一小段坐骨神經(jīng)(0。如前所述[12]，取下5e1cm)進行觀察，并對坐骨神經(jīng)的微觀結(jié)構(gòu)進行成像。

2.8.過氧化和抗氧化試驗粉碎大鼠坐骨神經(jīng)，均質(zhì)化。根據(jù)比色試劑盒(中國南京建成生物工程研究所)的說明書測定丙二醛(MDA)、抗氧化酶和超氧化物歧化酶(SOD)水平。

2.9.坐骨神經(jīng)促炎細胞因子及相關(guān)信號通路的檢測

制備坐骨神經(jīng)勻漿液，使用ELISA試劑盒(Uscnlife, TX, USA)定量白細胞介素-6(IL-6)和腫瘤壞死因子-a(TNF-a)的水平。取各組坐骨神經(jīng)切片，免疫組化法測定NFe kB水平。

2.10.統(tǒng)計分析

數(shù)據(jù)以均數(shù)±SD表示，使用SPSS13進行學生t檢驗和單因素方差分析。0軟件。P值<0。0.05為組間差異有統(tǒng)計學意義。

3.結(jié)果

3.1.各組體重、MBG、SDBG、 LAGE的比較

實驗前將三組大鼠體重匹配。分別于實驗第2、4、

6、8、12周測量體重。NC組體重隨時間增加而增加。但在第6、8和12周，DS和DF組的體重顯著低于 NC組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。0.05)，而DS組和DF組之間無顯著差異(圖1A)。第8周和第12周的每日MBG、SDBG和LAGE根據(jù)每周一天的7次每日血糖測量值計算。與NC組相比，DS組和DF組MBG、 SDBG和LAGE水平均顯著升高(P<0.05)。05).DF組SDBG和LAGE水平較DS組顯著升高(P<0.05)。05)(圖1B和D)。

3.2.GV會削弱認知能力

為了確定GV和高血糖對認知功能的影響，在第8周進行了降壓被動回避試驗。與NC組相比,反應時間和數(shù)量的錯誤在DS和DF組顯著增加,水平最高的DF組(表1)。記憶測試表明,延遲時間明顯減少DS和DF組相比，在數(shù)控集團和DF組顯示最低的延遲時間(表1)。相反,錯誤的數(shù)量增加的DS和DF組,和DF組顯示最多的錯誤。這些結(jié)果表明，高血糖可損害大鼠的認知功能，尤其是GV。

3.3.GV促進海馬中Tau蛋白的磷酸化

Tau過度磷酸化和積累在認知能力下降中起重要作用。在第8周，我們觀察了海馬中p-Tau(pSer202/ Thr205,At-8)和總Tau (Tau5)的表達(圖2A)。結(jié)果顯示，與NC組相比，DS組和DF組p-Tau表達水平升高，DF組p-Tau表達水平高于DS組。但三組間總Tau蛋白含量無明顯差異。此外，p-Tau與T-Tau的比值增加了1。79折和2。DS組和DF組分別是對照組的20倍。DF組的這一比例明顯高于DS組。這些結(jié)果表明，與高血糖相比，GV可能會導致海馬中Tau磷酸化的增加。

3.4.GV通過增加Akt/GSK3b活性促進Tau磷酸化

既往研究表明Akt/GSK3b信號通路可能參與Tau磷酸化。我們在第8周評估了磷酸化Akt(p-Akt)和磷酸化GSK3b(p-GSK3b)在海馬中的表達(圖2B和C)。

Western blot顯示，與NC組相比，DS組的p-GSK3b水平下降了31%，DF組下降了56%。特別是，與DS組相比，DF組p-GSK3b水平明顯降低。此外，對p-Akt蛋白水平的評估顯示，三組的結(jié)果相似，DF組的抑制效果最大。這些結(jié)果表明，Akt/GSK3b信號通路可能參與了gv驅(qū)動Tau磷酸化的機制。

3.5.GV削弱了坐骨神經(jīng)的MNCV

接下來觀察GV和高血糖對周圍神經(jīng)的影響。第12周測定坐骨神經(jīng)的MNCV。平均mncv為52。NC組為69 m/s,36。DS組為35m/s;DF組為96m/s。此外，DF組的MNCV顯著低于DS組(圖3A)。

3.6.GV影響坐骨神經(jīng)的微觀結(jié)構(gòu)

為了進一步評估坐骨神經(jīng)損傷，我們用電子顯微鏡觀察了坐骨神經(jīng)的微觀結(jié)構(gòu)。NC組髓鞘厚度均勻，呈致密有序的同心圓。此外，軸突的線粒體結(jié)構(gòu)非常清晰(圖3B)。DS組髓鞘散在，卷曲，有裂隙。軸突線粒體結(jié)構(gòu)不清楚(圖3C)。此外，DF組髓鞘厚度極不均勻。與DS組相比，DF組軸突排列更加紊亂、松散、不清晰，線粒體腫脹(圖3D)。

3.7.GV影響過氧化和抗氧化活性

既往研究表明，SOD和MDA的變化反映了氧化應激狀態(tài)。結(jié)果表明，DF組SOD活性(u/mg蛋白)顯著低于對照組(31。95±2。65例，DS組36例。02±4。32)，與NC組(48。94±4。DF組MDA含量(nmol/mg蛋白)提高了71。與NC組相比，增加了7%，增加了9%。與 DS組相比減少了2%(圖4A)。這些結(jié)果表明，與高血糖相比，GV誘導的抗氧化能力抑制更大，氧化損傷增加。

3.8.GV影響促炎細胞因子和NF-kB的表達

為了研究炎癥在糖尿病引起的坐骨神經(jīng)損傷中的作用，我們接下來檢查了圖2。第8周時，GV影響海馬中Tau、Akt和GSK3b的磷酸化。A.與NC組相比，DS組和DF組p-Tau水平升高，DF組p-Tau表達水平高于 DS組。B.p-GSK3b的表達在DS組下降31%，DF組下降56%。DF組p-GSK3b水平明顯低于DS組。C.此外，對P-akt蛋白水平的評估顯示，三組的結(jié)果相似(*P<

0.05)。05 vs NC，**P<0。01 vs NC，#P<0。05vs DS，每組1/8)。TNF-a和IL-6在坐骨神經(jīng)中的表達。DF組TNF-a和IL-6水平明顯高于NC組和DS組(圖4B)。NF-kB信號通路可能參與氧化應激和炎癥反應。免疫組化結(jié)果顯示NC組NF-kB蛋白表達較弱，主要在雪旺細胞中表達。相比之下，DS和DF組表現(xiàn)出更多的NF-kB陽性細胞，包括雪旺細胞以及血管內(nèi)皮細胞和軸突(圖4C)。此外，三組的平均光密度(AOD)顯示 DF組NF-kB的相對表達量最高。綜上所述，這些結(jié)果表明GV誘導的炎癥反應比持續(xù)性高血糖更強，NFe kB可能參與了這一過程。

4.討論

GV具有更廣泛的含義，可以指全天發(fā)生的血糖波動，也可以指在不同天的同一時間發(fā)生的血糖波動。 GV并不總是有負面影響，因為血糖的變化不僅是參與葡萄糖代謝的激素晝夜節(jié)律的生理結(jié)果，也是碳水化合物攝入的生理結(jié)果[19]。雖然在糖耐量正常的受試者中也觀察到一定程度的變異性，但在葡萄糖調(diào)節(jié)受損的患者和糖尿病患者中，GV增加[20]。近年來，人們對GV與糖尿病慢性并發(fā)癥之間的關(guān)系越來越感興趣，越來越多的臨床數(shù)據(jù)表明，GV可能促進糖尿病微血管并發(fā)癥的發(fā)展[21]。為了探討GV與糖尿病神經(jīng)病變的關(guān)系，我們構(gòu)建了GV動物模型，DF組SDBG和LAGE值明顯升高證實了該動物模型的成功構(gòu)建。糖尿病性神經(jīng)病變是指由糖尿病引起的一系列神經(jīng)功能障礙。在病程中，糖尿病患者全身可能出現(xiàn)神經(jīng)損傷，包括中樞和周圍神經(jīng)系統(tǒng)。糖尿病中樞神經(jīng)病變以進行性認知障礙為特征，最終可能發(fā)展為癡呆[3]。既往研究表明，糖尿病與進行性認知能力下降相關(guān)，并可加速阿爾茨海默病(AD)[22,23]。海馬是一個重要的認知器官;動物研究表明，糖尿病通過多種機制導致海馬神經(jīng)元凋亡，包括氧化應激、凋亡調(diào)節(jié)基因表達紊亂和線粒體功能缺陷[24]。雖然一些研究表明GV是認知障礙和癡呆的危險因素[4,8,14]，但其內(nèi)在機制有待進一步探討。在此，我們采用降壓被動回避實驗來評估GV對大鼠認知功能的影響，我們發(fā)現(xiàn)高血糖對大鼠的學習和記憶能力都有影響，尤其是GV，這表明GV對大鼠的認知功能有影響。Tau蛋白的異常過度磷酸化被認為在神經(jīng)破壞和認知障礙中發(fā)揮作用[2,7,25]。我們測量了海馬中p-Tau和T-Tau的表達，發(fā)現(xiàn)GV促進了海馬中Tau的磷酸化。為了進一步探索其中的信號通路，我們重點研究了GSK-3b,GSK-3b是參與Tau蛋白超磷酸化的重要激酶，其失調(diào)參與了AD的病理過程[26]。GSK-3b磷酸化降低已被證明可介導 Tau蛋白在體內(nèi)的過度磷酸化[27]。GSK-3b的上游調(diào)控因子Akt的磷酸化也在我們的研究中進行了評估。正如預期的那樣，海馬中Akt/GSK3b信號被GV抑制，這與腎臟中觀察到的結(jié)果一致[11]。因此，GV可能通過抑制Akt/GSK3b通路導致海馬區(qū)Tau過度磷酸化，從而誘導糖尿病中樞神經(jīng)病變。除糖尿病中樞神經(jīng)病變外，GV對DPN的影響也已得到證實[12,13]。我們的研究結(jié)果表明，GV削弱了坐骨神經(jīng)的MNCV，特別是在DF組。雖然持續(xù)的慢性高血糖是糖尿病神經(jīng)元損傷的主要原因，但在氧化應激和炎癥細胞因子方面，葡萄糖水平的急性波動或大范圍變化可能比持續(xù)高血糖更嚴重地惡化致病介質(zhì)[28]。此外，有研究發(fā)現(xiàn)間歇性高糖(IHG)誘導與氧化應激相關(guān)的雪旺細胞凋亡，且IHG的細胞毒作用明顯強于高糖[14]。因此，我們觀察GV對坐骨神經(jīng)微觀結(jié)構(gòu)的影響，并進一步探討氧化應激和炎癥指標的變化，以闡明可能的機制。正如預期的那樣，髓鞘和軸突的結(jié)構(gòu)都被高血糖和GV破壞，并且DF組的影響更嚴重。此外，GV顯著降低 SOD表達，增加MDA表達。TNF-a、IL-6和NF-kB的表達水平也因GV升高而升高。綜上所述，我們提出GV通過誘導氧化應激和炎癥反應導致周圍神經(jīng)損傷的假設(shè)，而NF-kB通路可能參與了這一過程?？傊壳暗墓ぷ鲝娬{(diào)了GV對糖尿病神經(jīng)病變的作用，包括糖尿病中樞神經(jīng)病變和DPN。我們發(fā)現(xiàn)GV可能通過抑制Akt/GSK3b通路導致海馬區(qū)Tau過度磷酸化誘導糖尿病中樞神經(jīng)病變，并可能通過激活NF-kB通路引起氧化應激和炎癥反應導致DPN。我們的研究有一些局限性。我們只觀察了不同組中Akt/GSK3b和NF-kB的表達。需要基因敲除或過表達研究來進一步評估這些通路在gv誘導的糖尿病神經(jīng)病變中的作用。然而，我們的研究提供了一些可能的機制，并為未來的治療靶向開辟了額外的途徑。網(wǎng)址:https://doi。org/10。1016/j。bbrc。2018.12.179.